2018-08-01
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為抵御各種各樣的病原體，人類或哺乳動物的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)擁有大量的T細胞受體(TCRs)和B細胞受體(BCRs)，統(tǒng)稱為免疫組庫。高通量測序（NGS）技術(shù)允許對T或B細胞克隆進行深入分析，能夠在檢測T或B細胞時提供前所未有的精細度。
該技術(shù)可以有效評估TCR或BCR互補決定區(qū)域(CDR3)的多樣性，并評估克隆類型的構(gòu)成：包括特定克隆類型的比例；克隆之間的相似程度；V(D)J基因的使用頻率；核苷酸插入與缺失；CDR3區(qū)域長度分布等信息。因此，免疫組庫高通量測序為評估健康或疾病狀態(tài)下的機體適應(yīng)性免疫系統(tǒng)提供了可能。
高通量測序技術(shù)可快速便捷地對免疫組庫進行全景式的掃描，但其涉及的PCR反應(yīng)會導(dǎo)致假陽性增加以及擴增偏倚，從而對數(shù)據(jù)結(jié)果的準確性造成潛在影響。
目前，現(xiàn)有的免疫組庫技術(shù)主要分為兩類：
1.基于多重PCR的文庫構(gòu)建方案：以DNA為模板，針對可變區(qū)（CDR3）設(shè)計多對引物，擴增出CDR3區(qū)段，再進行文庫構(gòu)建并測序；
2.基于5'RACE的文庫構(gòu)建方案：以mRNA為模板，在恒定區(qū)設(shè)計引物逆轉(zhuǎn)錄擴出TCR或BCR的全長序列，經(jīng)過兩輪PCR富集這一目的序列，再進行文庫構(gòu)建并測序。
但是，現(xiàn)有的基于多重PCR的文庫構(gòu)建方案存在明顯不足之處：該方法同時進行幾十種引物的擴增，體系異常復(fù)雜；多重引物設(shè)計需已知參考序列，不能充分捕捉到人類等位基因突變序列；多種引物擴增效率可能存在偏倚，難以等效擴增；與使用mRNA構(gòu)建文庫相比，DNA所需的PCR反應(yīng)體系較大，樣本要求較高。
技術(shù)升級一：
廣州華銀健康科技有限公司推出全新的免疫組庫測序技術(shù)服務(wù)，基于5'RACE原理，并在原始模板擴增前引入UMI（Unique Molecular Indices，分子條形碼）進行文庫構(gòu)建：以恒定區(qū)單引物逆轉(zhuǎn)錄擴增出CDR區(qū)
域全長序列的同時，引入UMI序列，可對后續(xù)PCR反應(yīng)或測序過程中引入的錯誤進行有效糾正，從而提高準確率。
技術(shù)升級二：
在逆轉(zhuǎn)錄環(huán)節(jié)，廣州華銀健康科技有限公司設(shè)計了針對微量樣品（低至100個細胞）的實驗流程：即通過oligo dT磁珠捕獲mRNA，以磁珠上的oligo dT為逆轉(zhuǎn)錄引物合成cDNA，并純化回收cDNA，較常規(guī)方法可大大提高效率，保證了人或小鼠來源的微量樣品的實驗成功率。
全新免疫組庫測序技術(shù)服務(wù)亮點
1.可滿足微量樣品建庫的實驗要求（最低可至100個細胞），兼容人以及小鼠樣本
微量RNA起始建庫流程圖
2.低RNA起始量的樣本也能快速達到測序飽和期，相同RNA起始量下的樣本其相關(guān)度較高
同一樣本RNA起始量不同時到達測序飽和期數(shù)據(jù)統(tǒng)計曲線圖
同一樣本RNA起始量相同時樣本間的相關(guān)性圖
（A1/A2/A3為起始RNA量為1600ng; B1/B2/B3為起始量為400ng; C1/C2/C3為起始量為50ng）
3.基于強大的UMI標記與校正算法，可有效糾正PCR與測序過程引入的錯誤與偏倚，極大地提高準確度
經(jīng)過UMI算法校正后的部分測試數(shù)據(jù)統(tǒng)計表
4.對測序下機數(shù)據(jù)進行多維度分析，給出最全面的數(shù)據(jù)結(jié)果報告，并可定制個性化分析服務(wù)
參考文獻：
1.Abbas A K, et al. Cellular & Molecular Immunology 6e[J].
2.Hou X L, et al. Current status and recent advances of next generation sequencing techniques in immunological repertoire[J]. Genes & Immunity, 2016, 17(3):153.
3.Lefranc, et al. "IMGT?, the international ImMunoGeneTics information system?." Nucleic acids research 37.suppl_1 (2008): D1006-D1012.
4.Chunlin Wang, et al. High throughput sequencing reveals a complex pattern of dynamic interrelationships among human T cell subsets. PNAS, 2010, vol. 107:1518–1523.
5.Jennifer Benichou, et al. Rep-Seq: uncovering the immunological repertoire through next-generation sequencing. Immunology, 2011, 135: 183–191.
6.Jeroen W J van Heijst, et al. Quantitative assessment of T cell repertoire recovery after hematopoietic stem cell transplantation. Nature Medicine, 2013,VOL.19: 372-379.
7.Miran Jang, et al. Characterization of T cell repertoire of blood,tumor, and ascites in ovarian cancer patients using next generation sequencing. OncoImmunology, 2015, Vol.4:e1030561-1-10.
8.Evaggelia Liaskou, et al. High-throughput T-cell receptor sequencing across chronic liver diseases reveals distinct disease-associated repertoires. Hepatology, 2015,1-10.
9.Bates S T, et al. Global biogeography of highly diverse protistan communities in soil[J]. The ISME journal, 2013,7(3): 652-659.
